Fabricación y preparación de células estromales mesenquimales derivadas de placenta humana para entrega de tejido local.

INTRODUCCIÓN: Las células estromales mesenquimales (MSC) son un tipo de células madre que se pueden aislar de varias fuentes de tejido, incluida la médula ósea, el tejido adiposo, el cordón umbilical y la placenta. Estas células son de interés para los investigadores por su posible aplicación en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que las células estromales mesenquimales derivadas de la placenta (PMSC) son fácilmente expandibles y secretan una gran cantidad de factores angiogénicos e inmunomoduladores que se cree que provocan efectos paracrinos in vivo, modulando las respuestas endógenas de curación de heridas del cuerpo. También descubrimos que estas células son compatibles con una amplia gama de vehículos y matrices de entrega que pueden ayudar en su entrega local al sitio de la lesión. En este estudio, describimos el desarrollo de un proceso compatible con las buenas prácticas de fabricación actuales (CGMP) para aislar, expandir y almacenar PMSC para su uso como terapia con células madre. Nuestro proceso incluye pasos tomados para evaluar la pureza y esterilidad de estas células, todo lo cual puede adaptarse rápidamente a la producción de células CGMP en un ensayo clínico futuro. Además, caracterizamos la compatibilidad de las PMSC con una matriz extracelular aprobada por la FDA derivada de la submucosa del intestino delgado porcino (SIS-ECM, Cook Biotech) que puede usarse como vehículo para la administración local precisa de células. MÉTODOS. Se aislaron PMSC de tres donantes a partir de tejido de vellosidades coriónicas placentarias utilizando una metodología de cultivo de explante. Las células se aislaron, ampliaron y criopreservaron en bancos de células originales y de trabajo. Se examinaron las PMSC para determinar su esterilidad, ausencia de especies de Mycoplasma contaminantes y niveles bajos de endotoxinas. El fenotipo celular se calificó mediante citometría de flujo para examinar la expresión de marcadores de superficie de MSC bien establecidos y la expresión de marcadores de pluripotencia. La multipotencia de las PMSC se demostró mediante ensayos de diferenciación de tres linajes y se determinó que las células tenían cariotipos normales. La densidad de carga óptima y la viabilidad de las PMSC en SIS-ECM se determinaron mediante ensayos de proliferación celular MTS y ensayos fluorescentes vivos/muertos, respectivamente. La secreción de factores de crecimiento angiogénicos y neuroprotectores se analizó mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). RESULTADOS. Las EMSP se ampliaron y bancarizaron rápidamente. Los bancos de células viables principales y de trabajo se mantuvieron estables con una disminución mínima en la viabilidad a los 6 meses. Todas las PMSC eran estériles, libres de especies de micoplasmas, cariotípicamente normales y tenían niveles bajos de endotoxinas. Las PMSC eran homogéneas según el inmunofenotipado y expresaban pocos o ningún marcador de pluripotencia. La densidad de carga óptima en SIS-ECM fue de 3 a 5 × 105 células/cm2, y las células sembradas fueron >95% viables. La secreción de factores angiogénicos y neurotróficos fue detectable en las PMSC sembradas en plástico y SIS-ECM con variabilidad entre lotes de donantes. DISCUSIÓN. Las PMSC de tejidos placentarios pueden expandirse rápidamente y almacenarse en bancos de células estables y viables que estén libres de agentes contaminantes, sean genéticamente normales y fenotípicamente puras. La entrega local de PMSC se puede lograr utilizando SIS-ECM, que aquí se demostró que mantiene la viabilidad celular y la secreción de proteínas. Si bien nuestro trabajo aquí sienta una base sólida en el desarrollo de procedimientos de aislamiento y fabricación de células orientados clínicamente, es necesario realizar trabajos futuros in vivo para optimizar aún más la siembra y el trasplante de células para maximizar las capacidades terapéuticas.