Las iPSC humanas se pueden diferenciar en células notocordales que reducen la degeneración del disco intervertebral en un modelo porcino.

Introducción: Hasta el 80% de la población adulta experimenta dolor de espalda en algún momento de su vida. Estudios anteriores han indicado un vínculo entre el dolor de espalda y la degeneración del disco intervertebral (DIV). A pesar de décadas de investigación, existe una necesidad urgente de una terapia sólida con células madre dirigida a las causas subyacentes en lugar de a los síntomas. Se ha propuesto que las células notocordales (NC) parecen ser el tipo de célula ideal para regenerar el DIV: estas células desaparecen en los humanos a medida que maduran, son reemplazadas por células del núcleo pulposo (NP) y su desaparición se correlaciona con el inicio de la degeneración. del disco. Las NC humanas son escasas, por lo que aquí el objetivo es la generación de células de tipo notocordal a partir de células pluripotentes inducidas (iPSC). Métodos: Se generaron iPSC humanas a partir de fibroblastos dérmicos normales transfectando plásmidos que codifican seis factores: OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 y p53 shRNA. Luego, las iPSC se trataron con GSK3i para inducir la diferenciación hacia el mesodermo Primitive Streak (PSM). La diferenciación se confirmó mediante qRT-PCR e inmunofluorescencia. Las células PSM se transfectaron con plásmido codificante de Brachyury (Br) y las células se encapsularon en hidrogel Tetronic-tetraacrilato-fibrinógeno (TF) que imita el entorno NP (G'=1kPa), se cultivaron en condiciones hipóxicas (2% O2) y con medios de crecimiento específicamente definidos. Las células también se probaron in vivo en un modelo animal grande. La degeneración del IVD se indujo después de una punción anular en cerdos, 4 semanas después se inyectaron las células y los IVD se analizaron 12 semanas después de la lesión mediante resonancia magnética, análisis de expresión génica e histología. Resultados: Después de una exposición a corto plazo de las iPSC a GSK3i, hubo un cambio significativo en la morfología celular, los marcadores del mesodermo de racha primitiva (PSM) (Brachyury, MIXL1, FOXF1) se regulaban positivamente y los marcadores de pluripotencia (Nanog, Oct4, Sox2) se regulaban negativamente. ambos en comparación con el grupo de control. Las células PSM nucleofectadas con Br (PSM-Br) cultivadas en hidrogeles TF retuvieron el fenotipo NC de manera constante durante hasta 8 semanas, como se observa en el análisis de expresión génica. Las células PSM-Br se cultivaron conjuntamente con células madre mesenquimales (MSC) derivadas de la médula ósea (BM) que, con el tiempo, expresaron los marcadores NC en niveles más altos; sin embargo, los niveles de expresión en las BM-MSC solas no cambiaron. Se descubrió que los medios de condición iNC (iNC-CM) inducen una mayor expresión de genes marcadores NC y NP en BM-MSC humanas que NC-CM porcino. La punción anular indujo la degeneración del DIV tan pronto como 2 semanas después del procedimiento. Las iNC inyectadas se detectaron en los discos degenerados después de 8 semanas in vivo. Los discos tratados con iNC se encontraron protegidos de la degeneración. Esto fue evidente en el análisis histológico y los cambios en los niveles de pH, indicativos del estado de degeneración de los discos, observados mediante qCEST MRI. Las tinciones de inmunofluorescencia muestran que su fenotipo era consistente con el estudio in vitro, es decir, todavía expresaban los marcadores notocordales Queratina 18, Queratina 19, Noto y Brachyury. Conclusión: En el presente estudio, presentamos un método de diferenciación gradual para generar células notocordales a partir de iPSC humanas. Estas células no solo demuestran un fenotipo celular notocordal sostenible in vitro e in vivo, sino que también muestran la funcionalidad de las células notocordales y tienen un efecto protector en caso de degeneración inducida del disco y previenen el cambio en el nivel de pH de los DIV inyectados. El mecanismo de este efecto podría sugerirse a través del efecto paracrino sobre las células residentes, como se demostró en los estudios in vitro con MSC.