Edición del genoma altamente eficiente y sin marcadores de células madre pluripotentes humanas mediante recombinación homóloga mediada por donantes CRISPR-Cas9 RNP y AAV6.

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Año de publicación:
2019
Autores:
Renata M Martin, Kazuya Ikeda, M Kyle Cromer, Nobuko Uchida, Toshinobu Nishimura, Rosa Romano, Andrew J Tong, Viktor T Lemgart, Joab Camarena, Mara Pavel-Dinu, Camille Sindhu, Volker Wiebking, Sriram Vaidyanathan, Daniel P Dever, Rasmus O Bak, Anders Laustsen, Benjamin J Lesch, Martin R Jakobsen, Vittorio Sebastiano, Hiromitsu Nakauchi, Matthew H Porteus
Identificación de PubMed:
31051134
Subvenciones de financiación:
Resumen público:
La edición y corrección de genes en células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de patentes ofrece posibilidades interesantes para la medicina regenerativa, así como para el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Sin embargo, un desafío importante para lograr este objetivo es la baja eficiencia de la edición de genes utilizando métodos convencionales. Aquí, mostramos que se puede lograr una edición genética muy específica en iPSC humanas combinando nucleasas CRISPR/Cas9 con la entrega de plantillas de reparación de ADN de virus adenoasociados. Estos nuevos métodos abren nuevas e interesantes aplicaciones para las iPSC en investigación y medicina.
Resumen científico:
La edición del genoma de células madre pluripotentes humanas hPSC ofrece poderosas oportunidades para el modelado de enfermedades in vitro, el descubrimiento de fármacos y la terapia personalizada basada en células madre. Actualmente, sólo se pueden diseñar pequeñas ediciones con alta frecuencia, mientras que las modificaciones más grandes adolecen de una baja eficiencia y la consiguiente necesidad de marcadores de selección. Aquí, describimos la edición del genoma sin marcadores en hPSC utilizando ribonucleoproteínas Cas9 (RNP) en combinación con la entrega de plantilla de reparación de ADN mediada por AAV6. Informamos frecuencias de integración bialélicas y altamente eficientes en múltiples loci y líneas hPSC, logrando frecuencias de edición monoalélicas de hasta el 94% en el locus HBB. Usando este método, mostramos una corrección bialélica robusta de mutaciones de células falciformes homocigotas en una línea de PSC inducida por paciente (iPSC). Por lo tanto, esta estrategia muestra una utilidad significativa para generar hPSC con grandes integraciones de genes y/o cambios de un solo nucleótido a alta frecuencia y sin la necesidad de introducir genes de selección, mejorando la aplicabilidad de la edición de hPSC para investigación y usos traslacionales.