Un mutante Cas9 de alta fidelidad administrado como un complejo de ribonucleoproteína permite la edición genética eficiente en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas.
Año de publicación:
2018
Identificación de PubMed:
30082871
Subvenciones de financiación:
- Desarrollo preclínico de la terapia de corrección genética de células madre hematopoyéticas para SCID-X1
- Edición del genoma de células madre hematopoyéticas autólogas para tratar la anemia de células falciformes
- Edición del genoma para corregir mutaciones de fibrosis quística en células madre de las vías respiratorias
Resumen público:
Este artículo describe una mejora de uno de los componentes del sistema de edición de genes CRISPR/Cas9. La edición de genes en células de mamíferos se ha visto revolucionada por la aplicación de CRISPR/Cas9 bacteriano. La proteína bacteriana Streptococcus pyogenes Cas9 ha sido el sistema CRISPR más utilizado. Su uso para la edición del genoma requiere la presencia de la proteína Cas9 y una guía que pueda identificar la pieza correcta de ADN para que la proteína Cas9 la edite. Sin embargo, a veces la guía puede llevar la proteína Cas9 a un ADN que es similar al ADN correcto pero que no es el sitio deseado; esto se denomina "fuera del objetivo" y puede provocar eventos de edición mediados por Cas9 no deseados. Hemos diseñado una nueva proteína Cas9 que tiene una especificidad mucho mayor por su secuencia objetivo correcta en el genoma, lo que reduce drásticamente la edición fuera del objetivo. Este Cas9 (HiFi) diseñado es ampliamente aplicable tanto en aplicaciones básicas como terapéuticas.
Resumen científico:
La traducción del sistema CRISPR-Cas9 a la terapéutica humana es muy prometedora. Sin embargo, la especificidad sigue siendo una preocupación, especialmente cuando se modifican poblaciones de células madre. Mostramos que las variantes existentes de alta fidelidad de Cas9 diseñadas racionalmente han reducido la actividad en el objetivo cuando se utiliza el método de administración de ribonucleoproteína (RNP) terapéuticamente relevante. Por lo tanto, ideamos una pantalla bacteriana imparcial para aislar variantes que retengan actividad en el formato RNP. La introducción de una mutación de un solo punto, p.R691A, en Cas9 (Cas9 de alta fidelidad (HiFi)) mantuvo la alta actividad en el objetivo de Cas9 al tiempo que redujo la edición fuera del objetivo. HiFi Cas9 induce un gen robusto mediado por AAV6 que se dirige a cinco loci terapéuticamente relevantes (HBB, IL2RG, CCR5, HEXB y TRAC) en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) CD34(+) humanas, así como en células T primarias. También mostramos que HiFi Cas9 media la corrección de alto nivel de la mutación p.E6V que causa la anemia falciforme (SCD) en HSPC derivadas de pacientes con SCD. Anticipamos que HiFi Cas9 tendrá una amplia utilidad tanto para aplicaciones de ciencia básica como de edición terapéutica del genoma.
