Edición del genoma con editores de bases programables en células humanas.

Desde la adaptación revolucionaria de CRISPR-Cas9 para la edición programable del genoma, el campo se ha expandido rápidamente. En 2016, la caja de herramientas de edición del genoma se amplió con la incorporación de editores de base (BE). Estas herramientas instalan mutaciones de un solo nucleótido en el genoma modificando directamente las bases de ADN objetivo. Si bien las aplicaciones de la edición de bases son amplias, comúnmente se utilizan para modelar variantes de un solo nucleótido (SNV) en líneas celulares de mamíferos. En este trabajo, describimos claramente métodos clave para la edición del genoma utilizando editores de bases en células humanas. Generalmente, los editores de bases están compuestos por una desaminasa N-terminal fusionada a una proteína nickasa Cas9 (nCas9), con señales de localización nuclear (NLS) N- y C-terminales. Primero discutimos su arquitectura, luego detallamos consideraciones para su uso. Esto incluye tener en cuenta la disponibilidad del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) cerca del nucleótido objetivo y los motivos de secuencia favorecidos por las diferentes combinaciones disponibles de proteína desaminasa y Cas9. También se comparan las desaminasas comúnmente disponibles, lo que permite a los lectores seleccionar la mejor BE para sus necesidades específicas. Una vez seleccionado un BE, abordamos cómo diseñar ARN guía (gRNA) para usar con editores de bases y construcciones de expresión de gRNA de clones. Este trabajo también analiza varios componentes de diferentes construcciones de expresión de gRNA y proporcionamos métodos confiables para la generación de estas construcciones, desde la clonación hasta la transformación y secuenciación de la construcción para garantizar la precisión. Después de la selección de BE y el diseño de gRNA, estas construcciones deben administrarse a las células de mamíferos. Como existe una variedad de métodos para este fin, proporcionamos métodos detallados para la transfección basada en lípidos, la electroporación y la transposición y transducción de componentes. En primer lugar, analizamos los métodos de transfección directa e inversa utilizando lípidos catiónicos. Algunos tipos de células no son susceptibles a la transfección con lípidos catiónicos y, por lo tanto, ofrecemos dos protocolos para tipos de células más sensibles: (1) electroporación y (2) codificación genómica de la construcción de BE inducible por moléculas pequeñas utilizando la transposición de piggyBac. El último método también analiza la administración de gRNA a través de la transducción lentiviral. La expresión de BE inducible por moléculas pequeñas es necesaria para una edición eficiente en células madre. Para evaluar la eficiencia de la edición, a menudo se utiliza la secuenciación de próxima generación (NGS), ya que proporciona datos sólidos sobre secuencias genómicas y es capaz de detectar niveles bajos de edición. Se analizan en profundidad los pasos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación y código de barras y se proporcionan guías detalladas para la resolución de problemas. Si la eficiencia de la edición es baja para ciertos objetivos y tipos de células, ofrecemos una estrategia de enriquecimiento que utiliza un reportero de plásmido fluorescente y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se analiza el diseño y la construcción del reportero, así como la preparación de muestras para FACS. Estas muestras enriquecidas pueden luego ser lisadas y sometidas a amplificación y codificación de barras para el análisis de secuencia. Si el objetivo del experimento es generar líneas celulares isogénicas utilizando BE, se proporciona un protocolo específico para Namocell, un instrumento de clasificación de células individuales que enriquece muestras de manera similar a un FACS.