Gen dirigido a una línea HUES de células madre embrionarias humanas mediante electroporación.

La ingeniería genética de células madre embrionarias (ES) humanas es importante por su aplicación como herramientas para la investigación básica y el desarrollo terapéutico. Específicamente, la orientación genética, la tecnología para modificar un gen endógeno mediante recombinación homóloga, tiene muchas aplicaciones potenciales en células ES humanas. Por ejemplo, los genes defectuosos se pueden reparar utilizando la orientación genética antes de que las células ES humanas o sus derivados se utilicen en terapias de trasplante. Los genes indicadores fluorescentes pueden introducirse dirigiéndose a un gen endógeno para controlar la expresión genética y rastrear linajes celulares. Las mutaciones pueden generarse mediante selección genética para evaluar la función de un gen endógeno en células ES humanas o sus derivados. Sin embargo, a diferencia de su homólogo de ratón, la tecnología de selección de genes en células ES humanas no está bien establecida. Se han publicado pocos informes sobre la selección exitosa de genes en células ES humanas. Incluso entre este número limitado de informes, los genes objetivo se limitaron en gran medida a genes que pueden seleccionarse o enriquecerse cuando se seleccionen, utilizando estrategias que no se adaptan a otros genes. En este artículo, describimos la orientación genética exitosa del gen Fezf2 en la línea celular ES humana HUES-9. Fezf2 es importante para el desarrollo de neuronas corticoespinales y relacionadas según el trabajo realizado en ratones. La expresión de Fezf2 también marca las neuronas corticoespinales. Al introducir un gen indicador fluorescente en el gen Fezf2 mediante la orientación genética, podremos controlar la expresión de Fezf2 en la línea celular objetivo tras la diferenciación adecuada. Esto nos permitirá desarrollar un protocolo más eficiente para diferenciar las células ES humanas hacia las neuronas corticoespinales en el futuro. Debido a que las neuronas corticoespinales (más precisamente su conexión entre el cerebro y la médula espinal) a menudo resultan dañadas en una lesión de la médula espinal, esta investigación algún día podría conducir al desarrollo de terapias de trasplante de células que traerían beneficios a los pacientes con lesión de la médula espinal. Nuestra experiencia con la orientación genética en Fezf2 también proporcionó varias lecciones valiosas para los investigadores de células madre que planean aplicar la orientación genética en su trabajo. Descubrimos que la línea celular ES humana HUES-9 tiene una alta tolerancia al paso enzimático y una alta capacidad de expansión clonal, lo que le da a esta línea celular una clara ventaja para los procedimientos de selección de genes que requieren disociación y electroporación de células individuales. Esta observación tiene amplias implicaciones, ya que anteriormente se pensaba que las células ES humanas se diferenciaban de sus homólogas de ratón debido a su escasa supervivencia después de la disociación enzimática. Nuestros resultados mostraron que la elección de la línea celular utilizada puede tener un efecto profundo en la capacidad de las células ES humanas para ser manipuladas genéticamente mediante selección genética. Este es el primer informe sobre la frecuencia de direccionamiento de genes para un gen no expresado en células ES humanas utilizando una estrategia que es aplicable a todos los genes humanos. Finalmente, las células HUES-9 pueden someterse a procedimientos de focalización genética sin pérdida aparente de sus características distintivas como células ES humanas, lo que es fundamental para su amplia utilidad en la investigación básica y clínica.