Sec. de ARNm de longitud completa a partir de niveles de ARN unicelulares y células tumorales circulantes individuales.
Año de publicación:
2012
Identificación de PubMed:
22820318
Subvenciones de financiación:
- Mecanismos moleculares de la especificación y autorrenovación de las células madre del trofoblasto
- Centro TSRI para la investigación de hESC
- Laboratorio colaborativo para la investigación de células madre embrionarias humanas en el Instituto de Investigación Médica Sanford-Burnham
- La matriz de células madre: un mapa de las vías moleculares que definen las células pluripotentes
- Garantizar la seguridad de la terapia celular: un proceso de control de calidad para la purificación y validación celular
Resumen público:
Por primera vez, capturamos células tumorales circulantes individuales de la sangre de pacientes con cáncer e identificamos todos los genes que están activos en estas células. Estas células pueden estar involucradas en la siembra de metástasis que se arraigan en otras partes del cuerpo. Desarrollamos dos nuevos métodos para lograr la secuenciación de células individuales: un nuevo sistema de captura de células para aislar células tumorales circulantes raras de la sangre y un nuevo método ("Smart-Seq") para analizar el ARN mensajero en células individuales mediante secuenciación de próxima generación. tecnología. Descubrimos que las células tumorales de melanoma circulantes expresan genes asociados con células pigmentarias normales (melanocitos) y con células cultivadas derivadas de tumores de melanoma. Para este ejemplo particular, podemos identificar nuevos biomarcadores para células tumorales circulantes que pueden ayudarnos a identificar y atacar las células madre cancerosas. Para el área más amplia de la investigación con células madre, la técnica de secuenciación de células individuales será valiosa para examinar células individuales en poblaciones de cultivos; por ejemplo, en un trabajo no publicado, hemos analizado múltiples células individuales extraídas de un cultivo de células similares a hepatocitos derivadas de células madre pluripotentes humanas. Al examinar la diversidad de perfiles de expresión genética entre células individuales en un cultivo, podemos determinar las identidades de las células, incluidas aquellas que son contaminantes con fenotipos inadecuados (células cardíacas en un cultivo de hepatocitos, por ejemplo). Esta técnica también se puede utilizar para identificar los tipos de neuronas que se desarrollan a partir de iPSC específicas de una enfermedad, comparándolas con muestras no enfermas. Dado que muchos trastornos neurológicos del desarrollo se caracterizan por una sobreabundancia o escasez de un tipo particular de neurona, podemos utilizar la técnica de una sola célula como medio para caracterizar experimentos de "enfermedad en un plato".
Resumen científico:
Los análisis del transcriptoma de todo el genoma se utilizan habitualmente para controlar la expresión genética específica de tejidos, enfermedades y tipos de células, pero ha sido un desafío técnico generar perfiles de expresión a partir de células individuales. Aquí describimos un protocolo robusto de mRNA-Seq (Smart-Seq) que es aplicable hasta niveles de células individuales. En comparación con los métodos existentes, Smart-Seq ha mejorado la cobertura de lectura en las transcripciones, lo que mejora los análisis detallados de isoformas de transcripción alternativas y la identificación de polimorfismos de un solo nucleótido. Determinamos la sensibilidad y la precisión cuantitativa de Smart-Seq para la transcriptómica unicelular evaluándola en series de dilución de ARN total. Descubrimos que, aunque las estimaciones de la expresión genética de células individuales han aumentado el ruido, se podrían identificar cientos de genes expresados diferencialmente utilizando pocas células por tipo de célula. Al aplicar Smart-Seq a células tumorales circulantes de melanomas, identificamos distintos patrones de expresión genética, incluidos biomarcadores candidatos para células tumorales circulantes de melanoma. Nuestro protocolo será útil para abordar problemas biológicos fundamentales que requieren perfiles de transcriptoma de todo el genoma en células raras.