Los elementos aislantes de cromatina bloquean el silenciamiento transgénico en líneas hESC diseñadas en un locus definido del cromosoma 13.

Los reporteros de linaje de líneas de células madre embrionarias humanas (hESC) son útiles para estudios de diferenciación y detección de fármacos. Anteriormente, creamos líneas informadoras impulsadas por un factor de elongación 1 alfa (promotor EF1alfa en un locus del cromosoma 13q32.3 en la línea hESC WA09 y una línea hESC anormal BG01V de una manera específica del sitio. La expresión de los informadores en estas líneas se mantuvo a largo plazo término cultivo en estado indiferenciado. Sin embargo, cuando estas células se diferenciaron en linajes específicos, se observó una reducción en la expresión informadora, lo que indica silenciamiento transgénico. Para desarrollar una estrategia de ingeniería genética eficiente y confiable en hESC, utilizamos elementos aislantes de cromatina para flanquear la copia única transgenes e integraron las construcciones de expresión combinadas a través de la tecnología de recombinación mediada por la integrasa PhiC31/R4 con precisión en el locus del cromosoma 13. Se colocaron dos copias de secuencias de doble aislante cHS4 adyacentes a 5' y 3' de las construcciones indicadoras del promotor. La proteína verde fluorescente ( GFP) fue impulsado por el potenciador temprano EF1alfa o CMV/promotor de beta actina de pollo (CAG). En las líneas hESC diseñadas, tanto para CAG-GFP como EF1alfa-GFP aisladas, la expresión constitutiva en el locus del cromosoma 13 se mantuvo durante un cultivo prolongado y en ensayos de diferenciación dirigidos hacia diversos tipos de neuronas, endodermo pancreático y progenie mesodérmica. En particular, aquí se describe la primera línea indicadora fluorescente hESC normal que expresa de manera robusta GFP tanto en el estado indiferenciado como en toda la diferenciación del linaje dopaminérgico. La estrategia dual de utilizar secuencias aislantes y la integración en el locus constitutivo del cromosoma 13 garantiza la expresión transgénica adecuada. Esta es una herramienta valiosa para el estudio del desarrollo de linajes, experimentos de ganancia y pérdida de función y modelado de enfermedades humanas utilizando hESC.